激光共聚焦掃描顯微鏡簡(jiǎn)介

一、 激光共聚焦顯微鏡的基本組成
  激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品，是當(dāng)今世界*先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。激光共聚焦顯微鏡利用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦的原理和裝置，以及通過(guò)針孔的選擇和PMT的收集，并帶有一套對(duì)其所觀察到的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像分析處理的系統(tǒng)軟件。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，它具有更高的分辨率，實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點(diǎn)。所以它問(wèn)世以來(lái)在生物學(xué)的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。
激光共聚焦顯微鏡主要有四部分組成：1、顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)。2、掃描裝置。3、激光光源。4、檢測(cè)系統(tǒng)。整套儀器由計(jì)算機(jī)控制，各部件之間的操作切換都可在計(jì)算機(jī)操作平臺(tái)界面中方便靈活地進(jìn)行。
1.1 顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)
　　顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成象質(zhì)量。顯微鏡光路以無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可方便地在其中插人光學(xué)選件而不影響成象質(zhì)量和測(cè)量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場(chǎng)復(fù)消色 差物鏡，有利于熒光的采集和成象的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺(tái)的移動(dòng)調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。
1.2 掃描裝置
　　LSCM使用的掃描裝置在生物領(lǐng)域一般為鏡掃描。由于轉(zhuǎn)鏡只需偏轉(zhuǎn)很小角度就能涉及很大的掃描范圍，圖象采集速度大大提高，512×512畫(huà)面每秒可達(dá)4幀以上，有利于那些壽命短的離子作熒光測(cè)定。掃描系統(tǒng)的工作程序由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。
1.3 激光光源
　　LSCM使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)。多激光器系統(tǒng)在可見(jiàn)光范圍使用多譜線(xiàn)氬離子激光器，發(fā)射波長(zhǎng)為457nm、488nm和514nm的藍(lán)綠光，氦氖綠激光器提供發(fā)射波長(zhǎng)為543nm的綠光，氦氖紅激光器發(fā)射波長(zhǎng)為633nm的紅光，新的405nm半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線(xiàn)，但是小巧便宜而且維護(hù)簡(jiǎn)單。
1.4 檢測(cè)系統(tǒng)
　　LSCM為多通道熒光采集系統(tǒng)，一般有三個(gè)熒光通道和一個(gè)透射光通道，能升級(jí)到四個(gè)熒光通道，可對(duì)物體進(jìn)行多譜線(xiàn)激光激發(fā)，樣品發(fā)射熒光的探測(cè)器為感光靈敏度高的光電倍增管PMT，配有高速12位A/D轉(zhuǎn)換器，可以做光子計(jì)數(shù)。PMT前設(shè)置針孔，由計(jì)算機(jī)軟件調(diào)節(jié)針孔大小，光路中設(shè)有能自動(dòng)切換的濾色片組，滿(mǎn)足不同測(cè)量的需要,也有通過(guò)光柵或棱鏡分光后進(jìn)行光譜掃描功能的設(shè)置。
二、激光共聚焦顯微鏡的特點(diǎn)以及在生物領(lǐng)域的應(yīng)用
傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)生物樣品的觀察中，激光共聚焦顯微鏡有如下優(yōu)越性：
1、對(duì)活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片進(jìn)行連續(xù)掃描，可獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像。
2、  可以得到比普通熒光顯微鏡更高對(duì)比度、高解析度圖象、同時(shí)具有高靈敏度、杰出樣品保護(hù)。
3、多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 掃描,時(shí)間序列掃描旋轉(zhuǎn)掃描、區(qū)域掃描、光譜掃描、同時(shí)方便進(jìn)行圖像處理。 
4、細(xì)胞內(nèi)離子熒光標(biāo)記，單標(biāo)記或多標(biāo)記，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測(cè)定及動(dòng)態(tài)變化。
5、熒光標(biāo)記探頭標(biāo)記的活細(xì)胞或切片標(biāo)本的活細(xì)胞生物物質(zhì)，膜標(biāo)記、**物質(zhì)、**反應(yīng)、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進(jìn)行同時(shí)多重物質(zhì)標(biāo)記，同時(shí)觀察； 
6、對(duì)細(xì)胞檢測(cè)無(wú)損傷、**、準(zhǔn)確、可靠和優(yōu)良重復(fù)性；數(shù)據(jù)圖像可及時(shí)輸出或長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 
   由于共聚焦顯微鏡的以上優(yōu)點(diǎn)，激光共聚焦顯微鏡在以下研究領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛：
1、細(xì)胞生物學(xué)：
如：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡機(jī)制；各種細(xì)胞器、結(jié)構(gòu)性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對(duì)紫外線(xiàn)引起的DNA損傷進(jìn)行觀察和定量；分析正常細(xì)胞和癌細(xì)胞細(xì)胞骨架與核改變之間的關(guān)系；細(xì)胞黏附行為等   
2、生物化學(xué)：
如：酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術(shù)可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術(shù)，進(jìn)行基因的表達(dá)檢測(cè)，使基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等檢測(cè)變的更加簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。
3、藥理學(xué)：
如：**對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)；**進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程、定位分布及定量 
4、生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)：
如：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動(dòng)態(tài)；動(dòng)物發(fā)育以及胚胎的形成，骨髓干細(xì)胞的分化行為；細(xì)胞膜電位的測(cè)量.熒光漂白恢復(fù)（FRAP）、熒光漂白丟失（FLIP）的測(cè)量等。 
5、遺傳學(xué)和組胚學(xué)：
如：細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷； 
6、神經(jīng)生物學(xué)：
如：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞； 
7、微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)：
如：**、寄生蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)； 
8、病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：
如：活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身**性**的診斷； 
9、**學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)。
如：**熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位，細(xì)胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位；對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)，熒光能量共轉(zhuǎn)移（FRET）。